Exercicis de biotecnologia — Biologia 2n Batxillerat

Perquè cada cicle de la PCR inclou una fase d'escalfament a temperatures molt altes (uns 95 °C) per separar les dues cadenes de DNA; una polimerasa normal es desnaturalitzaria i deixaria de funcionar en aquesta fase, i caldria afegir-ne de nova a cada cicle.

És parcialment certa: tot organisme transgènic és efectivament un OMG (porta un gen d'una altra espècie introduït per enginyeria genètica), però no tot OMG és transgènic, perquè un OMG també pot ser el resultat d'inactivar o corregir un gen propi de l'organisme, sense incorporar-hi cap gen d'una altra espècie.

És la molècula o l'organisme que transporta el gen d'interès fins a la cèl·lula que es vol modificar. Exemples: un plasmidi bacterià, un virus modificat o el bacteri Agrobacterium per a les plantes.

Lloc de reconeixement: GAATTC, de la posició 5 a la 10 de la cadena superior. Tall entre G i A a les dues cadenes.
Fragment esquerre: 5'-ATCGG-3' (cadena superior) i 3'-TAGCCTTAA-5' (cadena inferior). Fragment dret: 5'-AATTCTAGC-3' i 3'-GATCG-5'.
Palindròmica: la seqüència llegida en sentit 5' → 3' és la mateixa en les dues cadenes (GAATTC a dalt i, a baix, llegida de dreta a esquerra, també GAATTC); per això l'enzim talla les dues cadenes en punts simètrics.
Extrems cohesius: els talls estan desplaçats quatre nucleòtids, de manera que cada fragment queda amb una cua monocatenària (5'-AATT) complementària a la de qualsevol altre fragment tallat amb EcoRI; les cues s'aparellen per ponts d'hidrogen i la DNA lligasa pot unir-los. És la base per combinar DNA d'orígens diferents.

PCR → (5): amplificació exponencial amb cicles de desnaturalització, hibridació d'encebadors i extensió.
Electroforesi → (3): els fragments, carregats negativament, migren cap al pol positiu, i els petits avancen més.
Clonació reproductiva → (4): transferència nuclear a un òvul enucleat i implantació en una mare gestant.
Micropropagació → (1): les cèl·lules vegetals són totipotents i, amb hormones, regeneren plantes senceres, totes clons.
Seqüenciació → (2): és l'única tècnica que dona la seqüència; la PCR només diu si hi ha o no un fragment, o quina mida té.
Hibridació amb sonda → (6): la sonda s'aparella per complementarietat amb la seqüència diana, i el marcatge (fluorescent o radioactiu) la fa visible.

a) Certa. El nucli prové d'una cèl·lula somàtica (diploide) del donant, de manera que el clon en té el mateix genoma nuclear; només el DNA mitocondrial prové de l'òvul receptor.
b) Falsa. El fenotip depèn del genotip, de l'ambient (alimentació, experiències) i de marques epigenètiques que no es copien; els clons poden diferir en mida, taques del pelatge, caràcter o salut, com passa amb els bessons idèntics.
c) Certa. En la clonació terapèutica l'embrió obtingut es fa servir per derivar cèl·lules mare embrionàries compatibles amb el pacient, i no s'implanta.
d) Falsa. Precisament la novetat de la clonació per transferència nuclear és que es parteix del nucli d'una cèl·lula somàtica adulta (en el cas de l'ovella Dolly, de la glàndula mamària); el gàmeta que cal és un òvul d'un altre animal, al qual s'ha tret el nucli.

Origen de replicació: és la seqüència on comença la còpia del plasmidi; permet que es repliqui dins del bacteri independentment del cromosoma i que cada cèl·lula filla n'hereti còpies, de manera que el gen inserit es multiplica amb el cultiu.
Gen de resistència a un antibiòtic (gen marcador): permet seleccionar els bacteris que han incorporat el plasmidi. En sembrar el cultiu en un medi amb l'antibiòtic, només creixen els que l'han captat (la transformació és poc eficient: la majoria no el capten).
Lloc de tall únic: si l'enzim només talla el plasmidi en un punt, el plasmidi s'obre sense fragmentar-se, i el gen d'interès, tallat amb el mateix enzim, s'hi pot inserir per extrems cohesius i tancar amb la lligasa. Si hi hagués dos llocs, el plasmidi perdria un tros i no es podria recircularitzar correctament.

El DNA té càrrega negativa pels grups fosfat, de manera que migra cap al pol positiu (ànode).
El gel és una xarxa de porus: els fragments petits s'hi mouen més fàcilment i avancen més; els grans queden frenats. Ordre des del pou: 2000 pb (la més a prop del pou), 1200 pb i 500 pb (la més allunyada).
El marcador conté fragments de mides conegudes; comparant la posició de cada banda problema amb les del marcador es pot estimar la mida dels fragments. La distància recorreguda disminueix amb el logaritme de la mida, no proporcionalment a la mida.
El DNA no es veu a simple vista: cal tenyir-lo amb un colorant fluorescent i observar el gel amb llum ultraviolada o blava.

(a) Cèl·lules mare embrionàries: pluripotents, poden originar qualsevol tipus cel·lular del cos, però no un organisme sencer (no formen la placenta).
(b) Cèl·lules mare adultes (hematopoètiques): multipotents, només originen els tipus cel·lulars del seu teixit (les cèl·lules de la sang); s'utilitzen en els trasplantaments de medul·la.
(c) Cèl·lules iPS (pluripotents induïdes): pluripotents, com les embrionàries, però obtingudes reprogramant cèl·lules adultes; és el tipus que evita l'ús d'embrions i, a més, són genèticament del mateix pacient (sense rebuig).
(d) Totipotents: poden formar un organisme complet, incloent-hi els teixits extraembrionaris; aquesta capacitat es perd després de les primeres divisions.

És transgènic perquè conté un gen d'una espècie diferent (un bacteri), introduït per enginyeria genètica, que no s'hauria pogut incorporar per creuament.
Avantatge: la planta fabrica la seva pròpia defensa contra el corc (les larves que la mengen moren), de manera que es redueixen les pèrdues de collita i la quantitat d'insecticides químics polvoritzats, que afecten molts més insectes i contaminen el sòl i l'aigua.
La toxina Bt és una proteïna que només s'activa en el pH alcalí de l'intestí dels insectes i s'uneix a receptors específics de les seves cèl·lules intestinals; els mamífers tenen un estómac àcid, no tenen aquests receptors i la digereixen com qualsevol altra proteïna. De fet, les preparacions de Bt es fan servir com a insecticida biològic (també en agricultura ecològica) des de fa dècades.

(a) OMG TRANSGÈNIC: porta un gen d'una altra espècie (un bacteri). (b) OMG NO TRANSGÈNIC: se li ha alterat el genoma de manera dirigida, però no s'hi ha introduït cap seqüència de fora; només s'ha inactivat un gen propi. (c) CAP DE LES DUES: el creuament selectiu modifica el patrimoni genètic de la varietat, però ho fa per reproducció sexual i selecció, no per manipulació dirigida al laboratori. No és un OMG en el sentit tècnic ni legal del terme, encara que genèticament la varietat resultant pugui ser molt diferent de la de partida. (d) OMG TRANSGÈNIC: el bacteri porta un gen humà, d'una espècie ben diferent. El criteri per decidir-ho sempre és el mateix: primer, s'ha manipulat el genoma dirigidament? Si no, no és OMG. I si sí, el que s'hi ha posat ve d'una altra espècie? Si sí, és transgènic.

Agrobacterium és un bacteri del sòl que, de manera natural, infecta cèl·lules vegetals i els transfereix un fragment del seu plasmidi Ti, el T-DNA, que s'integra al genoma de la planta (és el que li provoca un tumor, la gal·la). Els enginyers genètics aprofiten aquesta capacitat: treuen del T-DNA els gens que provoquen el tumor i hi posen el gen d'interès. Com que el mecanisme de transferència ja existeix de manera natural en aquest bacteri, és molt més eficient que fer-ho amb un bacteri sense aquesta capacitat.

(a) COM A PRODUCCIÓ: la insulina humana produïda per bacteris amb DNA recombinant. Abans s'extreia de pàncrees de porc i de bou, amb un rendiment baixíssim, un cost alt, dependència dels escorxadors i risc de reaccions immunitàries perquè no era insulina humana. Ara se'n produeix una quantitat il·limitada en fermentadors, més pura, més barata i sense sacrificar cap animal: és més econòmic i més sostenible alhora. (b) COM A EINA D'ESTUDI: generar animals modificats en què s'ha inactivat un gen concret per veure quines funcions es perden, cosa que permet esbrinar per a què serveix aquell gen; o crear models animals que reprodueixen una malaltia humana per assajar-hi tractaments abans de provar-los en persones. Aquí el producte no és una substància sinó CONEIXEMENT. (c) Perquè reuneixen totes les condicions pràctiques: es reprodueixen en minuts, de manera que en poques hores hi ha milions de còpies de la modificació; es cultiven en gran quantitat i a baix cost en fermentadors controlats; el seu genoma és petit i fàcil de manipular, sobretot gràcies als plasmidis; i, com que el codi genètic és universal, poden expressar gens de qualsevol espècie, inclosos els humans.

Perquè determina qui es veu afectat pel canvi genètic: si la correcció es fa en cèl·lules somàtiques, l'efecte es limita exclusivament al pacient tractat i no es transmet a la seva descendència. Si es fes en cèl·lules germinals (òvuls, espermatozoides o embrions molt inicials), el canvi passaria a totes les generacions futures d'aquella persona, cosa que planteja qüestions ètiques molt més profundes (conseqüències irreversibles i no consentides per a persones que encara no existeixen), i per això la teràpia gènica en línia germinal és molt més restringida legalment que la somàtica.

a) Cada enzim té un sol lloc de tall: un DNA lineal amb un tall dona dos fragments (3 + 7 = 10 i 4 + 6 = 10).
b) Posem EcoRI a 3 kb d'un extrem (deixa 3 i 7). BamHI pot estar a 4 kb o a 6 kb d'aquest mateix extrem. Si fos a 6 kb, la digestió doble donaria 3, 3 i 4 kb; com que dona 3, 1 i 6, BamHI ha d'estar a 4 kb: fragments 0–3 (3 kb), 3–4 (1 kb) i 4–10 (6 kb). Mapa: extrem — EcoRI a 3 kb — BamHI a 4 kb — extrem a 10 kb.
Comprovació: 3 + 1 + 6 = 10 kb, i BamHI sol dona 4 i 6.
c) Si el DNA fos circular, un sol tall no el divideix: només l'obre i el converteix en una molècula lineal de 10 kb; es veuria una única banda de 10 kb. En un DNA circular, el nombre de fragments és igual al nombre de talls; en un de lineal, és el nombre de talls més un.

a) No tenen el gen de resistència: l'ampicil·lina els mata i no formen colònia. Així s'elimina la gran majoria de bacteris, que en la transformació no capten cap plasmidi.
b) Plasmidi sense insert (que s'ha tornat a tancar sol): el gen lacZ està sencer, la beta-galactosidasa és funcional, degrada el X-gal i la colònia és blava. Plasmidi recombinant: el fragment inserit interromp lacZ, l'enzim no es fabrica (o és inactiu), el X-gal no es transforma i la colònia és blanca.
c) L'antibiòtic només indica que el bacteri té plasmidi, però no diu si el plasmidi porta l'insert: en la lligació, molts plasmidis es tanquen sense incorporar res. El gen lacZ permet distingir, pel color, els recombinants (blancs) dels buits (blaus) i triar només les colònies blanques per continuar; després cal confirmar-ho per PCR o per restricció.
Error típic: dir que les colònies blaves són les recombinants; el blau indica que lacZ està intacte, és a dir, sense insert.

a) Els gens humans tenen introns, que s'eliminen en la maduració del mRNA per l'espliceosoma; els bacteris no tenen introns ni la maquinària per fer el splicing. El bacteri transcriu tot el gen, introns inclosos, i tradueix una proteïna amb seqüències extra o amb el marc de lectura trencat, que no és funcional.
b) S'extreu el mRNA madur de les cèl·lules de la hipòfisi (que ja no té introns) i, amb la transcriptasa inversa (enzim dels retrovirus), es copia a una cadena de DNA complementari (cDNA); després es fa la segona cadena amb DNA polimerasa. El cDNA conté només la seqüència codificant (els exons seguits) i és el que s'insereix en el plasmidi.
c) La RNA polimerasa bacteriana només reconeix promotors bacterians; el promotor humà necessita factors de transcripció eucariotes que el bacteri no té. Amb un promotor bacterià fort (i sovint induïble) el bacteri transcriu el cDNA i, com que el codi genètic és universal, els seus ribosomes el tradueixen a l'hormona humana.

a) El fill ha heretat un al·lel de cada progenitor: el 10 prové de la mare (que té 10 i 14), de manera que el 17 ha de venir del pare. L'home A té l'al·lel 17 i pot ser el pare; l'home B (13 i 15) no el té i queda exclòs amb seguretat.
b) Els encebadors s'uneixen a les seqüències fixes que flanquegen el STR, de manera que el producte de la PCR té una longitud que depèn del nombre de repeticions: cada repetició afegeix uns quants parells de bases. En el gel, els fragments se separen per mida i cada al·lel apareix com una banda en una posició diferent (una persona heterozigota mostra dues bandes).
c) Un sol STR exclou qui no comparteix cap al·lel amb el fill, però no demostra la paternitat: l'al·lel 17 el pot tenir molta gent de la població. Amb quinze STR independents, la probabilitat que un home no emparentat coincideixi en tots per atzar és ínfima (es multipliquen les probabilitats de cada locus), i la paternitat queda establerta amb una probabilitat superior al 99,99 %.

a) La DNA polimerasa de la PCR només copia DNA, i el genoma del virus és RNA. Primer cal fer una transcripció inversa (RT) amb la transcriptasa inversa, que copia el RNA víric a cDNA; aquest cDNA és el que s'amplifica després per PCR.
b) Són dos oligonucleòtids curts (uns 20 nucleòtids) complementaris als extrems del fragment que es vol amplificar, un per a cada cadena. La polimerasa només allarga a partir d'un encebador aparellat, de manera que només s'amplifica el fragment comprès entre tots dos: si els encebadors es dissenyen sobre una seqüència exclusiva del genoma d'aquest virus, no s'amplifica cap altre.
c) Control negatiu: no hi ha d'haver amplificació; si en surt, els reactius o el laboratori estan contaminats amb DNA i els positius de la tanda no són fiables (la PCR amplifica fins i tot una sola molècula). Control positiu: ha de sortir positiu; si no, els reactius o l'aparell han fallat i els negatius de la tanda no són vàlids.
d) Si la seqüència del virus canvia en la zona on s'ha d'aparellar l'encebador, aquest no s'hi uneix bé (sobretot si la mutació és a l'extrem 3'), la polimerasa no pot començar i el fragment no s'amplifica encara que hi hagi virus: la prova diu «negatiu» per error. Per això els tests fan servir més d'una diana del genoma.

a) En la població de males herbes hi havia, per mutació a l'atzar, alguns individus lleugerament tolerants a l'herbicida. Cada tractament elimina els sensibles i deixa reproduir els tolerants, que transmeten els seus al·lels; al cap d'unes generacions la resistència és majoritària. L'herbicida no crea la resistència: la selecciona, exactament com els antibiòtics seleccionen bacteris resistents.
b) Només per flux gènic a través del pol·len: caldria que la mala herba fos una espècie silvestre molt emparentada amb la soja, capaç de creuar-s'hi i de donar híbrids fèrtils. En la majoria de camps europeus no hi ha parents silvestres de la soja, de manera que l'explicació més probable és la de l'apartat a); però en altres cultius (colza, blat) sí que hi ha parents silvestres, i el risc de transferència del transgèn existeix.
c) El refugi manté una població d'insectes sensibles que no està sotmesa a la toxina Bt. Si apareix un insecte resistent al camp Bt, el més probable és que s'aparelli amb un de sensible del refugi; com que la resistència sol ser recessiva, els descendents heterozigots són sensibles i moren en menjar blat de moro Bt. Així es retarda molt l'evolució de poblacions resistents i s'allarga la vida útil de la tecnologia.

a) L'EPO necessita modificacions posttraduccionals: l'addició de cadenes de sucres (glicosilació) al reticle endoplasmàtic i a l'aparell de Golgi, i un plegament amb ponts disulfur correctes. Els bacteris no tenen aquests orgànuls ni els enzims de glicosilació: fabricarien la cadena d'aminoàcids, però sense els sucres la proteïna és inestable, s'elimina de pressa de la sang i no és funcional. La insulina és un pèptid petit sense glicosilació, que es pot plegar i processar després de purificar-la.
b) Els bacteris creixen molt de pressa (es dupliquen en 20–30 minuts), en medis barats i en fermentadors grans; el seu genoma és petit i fàcil de manipular amb plasmidis; i no tenen virus que puguin infectar humans. Els cultius de cèl·lules de mamífer són lents, cars, delicats i exigeixen controls estrictes.
c) Els llevats són eucariotes unicel·lulars: tenen reticle i Golgi, fan glicosilació i ponts disulfur, i secreten proteïnes al medi, però creixen de pressa i en medis senzills, com els bacteris. L'inconvenient és que els sucres que afegeixen no són exactament iguals que els humans, cosa que per a algunes proteïnes (com l'EPO) no és acceptable; per a d'altres (com l'antigen de la vacuna de l'hepatitis B) funcionen perfectament.

(a) L'ENZIM DE RESTRICCIÓ talla el DNA humà per obtenir el gen de la insulina i talla també el plasmidi bacterià, i com que és el mateix enzim tots dos queden amb extrems cohesius complementaris. La DNA LLIGASA segella les unions i deixa una molècula contínua. (b) És una molècula de DNA RECOMBINANT: combina DNA de dues espècies diferents. (c) Perquè el CODI GENÈTIC ÉS UNIVERSAL: la correspondència entre codons i aminoàcids és pràcticament la mateixa a tots els éssers vius, de manera que el ribosoma bacterià llegeix el gen humà igual que el llegiria una cèl·lula humana i en surt la mateixa proteïna. (d) Diversos: s'obté insulina HUMANA exacta, i no de porc o de bou, cosa que evita reaccions immunitàries en els pacients; se'n pot produir una quantitat il·limitada i constant, perquè els bacteris es multipliquen molt de pressa i en fermentadors controlats; és més barat i no depèn del subministrament d'escorxadors; i el producte és més pur i uniforme.

(a) La PCR (reacció en cadena de la polimerasa). Es basa a repetir cicles en què s'escalfa per separar les dues cadenes, es refreda perquè els encebadors s'hi uneixin, i una DNA polimerasa sintetitza la cadena complementària. Com que cada còpia serveix de motlle al cicle següent, el creixement és exponencial. (b) Cal conèixer la SEQÜÈNCIA DELS EXTREMS del fragment que es vol amplificar, per poder fabricar els encebadors complementaris que hi hibridin i delimitin la zona a copiar. (c) $2^{25}$ = 3,4·$10^{7}$ còpies, és a dir, uns 34 milions a partir d'una sola molècula inicial. Aquesta amplificació és el que permet detectar quantitats de DNA que d'altra manera serien indetectables. (d) Perquè el cicle inclou escalfar fins a prop de 95 °C per separar les cadenes, temperatura que desnaturalitzaria qualsevol proteïna normal. Es fa servir una polimerasa TERMORESISTENT, aïllada de bacteris que viuen en fonts termals, que conserva la conformació i, per tant, la funció a aquestes temperatures.

(a) Perquè els virus tenen, de manera natural, una capacitat que costaria molt de reproduir artificialment: reconèixer una cèl·lula, entrar-hi i introduir-hi el seu material genètic. Se li han hagut d'eliminar els gens que li permeten multiplicar-se i causar malaltia, conservant només la maquinària d'entrada, i s'hi ha substituït el genoma víric pel gen terapèutic. (b) NO. La medul·la òssia està formada per cèl·lules SOMÀTIQUES, i les mutacions o correccions en cèl·lules somàtiques no arriben als gàmetes. Els fills rebran els al·lels que hi hagi als òvuls o espermatozoides del pacient, que continuen portant la versió defectuosa. (c) Actuar sobre cèl·lules somàtiques afecta NOMÉS el pacient, que ha donat el seu consentiment i que és qui pateix la malaltia: èticament s'assimila a qualsevol altre tractament. Actuar sobre cèl·lules germinals modificaria el genoma de tota la descendència, que no pot consentir-hi, i el canvi es transmetria indefinidament a la població humana sense possibilitat de rectificar-lo si apareguessin efectes imprevistos. Per això la teràpia gènica germinal està prohibida a la pràctica totalitat dels països.

a) Colònies 1 i 3: una sola banda de 3 kb, la mida del plasmidi buit: el vector s'ha tornat a tancar sense insert (religació). Colònies 2 i 4: dues bandes, 3 kb (vector) + 1,5 kb (gen): són plasmidis recombinants, en què EcoRI allibera l'insert sencer perquè els dos llocs EcoRI s'han regenerat en la lligació.
b) El gen de resistència és al plasmidi, no a l'insert: qualsevol bacteri amb plasmidi, buit o recombinant, resisteix l'ampicil·lina. L'antibiòtic selecciona els transformats, però no distingeix els recombinants; per això cal l'anàlisi de restricció (o un marcador com lacZ).
c) El plasmidi recombinant fa 3 + 1,5 = 4,5 kb i té dos llocs HindIII: un al vector, a 0,2 kb de l'EcoRI del costat del promotor, i un dins l'insert. Si l'extrem 5' del gen (amb HindIII a 0,5 kb) queda al costat del promotor, els dos llocs disten 0,2 + 0,5 = 0,7 kb i l'altre fragment fa 4,5 - 0,7 = 3,8 kb: és la colònia 2. Si el gen està girat, el lloc HindIII de l'insert queda a 1,5 - 0,5 = 1,0 kb de l'extrem proper al promotor: fragments de 0,2 + 1,0 = 1,2 kb i 3,3 kb: és la colònia 4. Comprovació: 0,7 + 3,8 = 1,2 + 3,3 = 4,5 kb.
d) Com que els dos extrems tenen el mateix extrem cohesiu EcoRI, l'insert pot entrar en les dues orientacions amb la mateixa probabilitat. La RNA polimerasa, a partir del promotor, transcriu en un sol sentit: només si l'extrem 5' del gen és al costat del promotor (colònia 2) es transcriu la cadena correcta i s'obté el mRNA i la proteïna; en l'orientació inversa es transcriuria la cadena complementària, sense sentit. Per això es trien les colònies amb l'orientació correcta, o es fa servir clonació direccional amb dos enzims diferents.

a) 1. S'extreu una cèl·lula somàtica (per exemple, de la glàndula mamària o de la pell) de l'ovella A i es cultiva. 2. S'obté un òvul de l'ovella B i se li extreu el nucli (enucleació). 3. Es fusiona la cèl·lula somàtica (o s'hi injecta el nucli) amb l'òvul enucleat i s'activa el desenvolupament amb un estímul elèctric o químic. 4. L'embrió es cultiva fins a l'estadi de blastocist i s'implanta a l'úter de l'ovella C, que el gesta.
b) L'anyell tindrà la cara negra: el color depèn de gens nuclears, i el nucli (amb tot el genoma nuclear) prové de l'ovella A; és un clon d'A. El DNA mitocondrial prové del citoplasma de l'òvul de l'ovella B. L'ovella C no hi aporta cap material genètic.
c) El nucli d'una cèl·lula diferenciada té un patró d'expressió gènica molt especialitzat, amb marques epigenètiques (metilació del DNA, modificacions d'histones) que mantenen apagats els gens que no corresponen a aquell teixit. Perquè l'embrió es desenvolupi, el citoplasma de l'òvul ha de reprogramar el nucli i esborrar aquestes marques fins a l'estat totipotent; la reprogramació és incompleta en la majoria dels casos i els embrions moren o neixen amb anomalies.
d) Els tres primers passos serien iguals (ara amb una cèl·lula somàtica del pacient), però l'embrió no s'implantaria: en l'estadi de blastocist se n'extraurien les cèl·lules de la massa cel·lular interna per obtenir cèl·lules mare embrionàries pluripotents, genèticament idèntiques al pacient. Es podrien diferenciar al laboratori en neurones, cèl·lules del cor o cèl·lules beta per fer trasplantaments sense rebuig. Avui les cèl·lules iPS permeten obtenir un resultat semblant sense crear embrions.

a) El RNA guia és una molècula de RNA curta amb una seqüència complementària a la zona del gen que es vol tallar: s'aparella amb aquesta seqüència i hi condueix la Cas9. La Cas9 és una nucleasa que talla les dues cadenes del DNA en el punt indicat. Després del tall, la cèl·lula el repara: si se li subministra un motlle de DNA amb la seqüència correcta, el repara per recombinació homòloga copiant el motlle i la mutació queda corregida; si no, la reparació per unió d'extrems sol introduir petites delecions que inactiven el gen (útil, per exemple, per inactivar un gen que reprimeix l'hemoglobina fetal).
b) Els glòbuls vermells madurs no tenen nucli ni DNA i viuen només uns 120 dies: no es poden editar ni transmetrien el canvi. Les cèl·lules mare hematopoètiques tenen nucli, s'autorenoven durant tota la vida i originen tots els glòbuls vermells; corregint-les, totes les cèl·lules sanguínies que en derivin portaran el gen corregit de manera permanent.
c) Les cèl·lules mare de la medul·la es poden extreure fàcilment de la sang o de l'os, cultivar, editar, seleccionar les que estan ben corregides i reinjectar, i elles soles tornen a colonitzar la medul·la. Les cèl·lules de l'epiteli pulmonar no es poden extreure, editar i tornar a col·locar: caldria editar-les dins del cos (in vivo), fent arribar CRISPR a milions de cèl·lules de les vies respiratòries, amb vectors poc eficients i amb el problema de la renovació constant de l'epiteli.
d) No: només s'han modificat cèl·lules somàtiques (de la medul·la); els gàmetes del pacient conserven la mutació i la poden transmetre. El risc tècnic principal són els talls fora de diana: la Cas9 pot tallar en seqüències semblants a la del RNA guia en altres llocs del genoma i provocar mutacions no desitjades, fins i tot en gens relacionats amb el càncer; per això cal dissenyar guies molt específiques i comprovar les cèl·lules editades abans de reinjectar-les.

a) El creuament només combina al·lels que ja existeixen dins l'espècie (o en espècies molt properes amb què es pot hibridar). Cap varietat d'arròs fabrica beta-carotè a l'endosperma, de manera que no hi havia cap al·lel a seleccionar; els gens necessaris per completar la via metabòlica al gra s'havien d'obtenir d'altres espècies (narcís, bacteri), amb les quals l'arròs no es pot creuar.
b) El promotor determina on i quan s'expressa un gen. L'objectiu és acumular beta-carotè només al gra, que és el que es menja; expressar els enzims a tota la planta gastaria energia i recursos en teixits on no cal, podria alterar el metabolisme de les fulles (on ja es fa beta-carotè per a la fotosíntesi) i reduir el rendiment.
c) El DNA dels aliments, transgènic o no, es degrada a l'aparell digestiu fins a nucleòtids, igual que el DNA de qualsevol vegetal o animal que mengem cada dia (milions de gens aliens); no hi ha cap mecanisme perquè un gen d'un aliment s'integri al genoma de les nostres cèl·lules. El beta-carotè de l'arròs daurat és la mateixa molècula que la de les pastanagues.
d) A favor: aporta vitamina A a través d'un aliment bàsic ja consumit, sense canviar hàbits ni necessitar una distribució de suplements, i s'ha demostrat que el beta-carotè del gra es converteix en vitamina A en l'organisme. En contra: cal avaluar el flux gènic cap a varietats locals i silvestres d'arròs i la pèrdua de diversitat varietal, i la dependència tecnològica de patents i empreses, o el risc que desviï recursos de solucions més àmplies (dietes diversificades). Els arguments s'han de basar en dades, no en la idea que «transgènic» equival a «perillós».

a) Al·lel de 18 repeticions: 100 + 3·18 = 154 pb; al·lel de 42: 100 + 3·42 = 226 pb. En el gel apareixerien dues bandes: la de 154 pb més allunyada del pou (més petita) i la de 226 pb més a prop.
b) El pare (42) i la filla (42) desenvoluparan la malaltia: tenen un al·lel amb més de 40 repeticions, i com que és dominant n'hi ha prou amb un. El fill (18 i 20) no: tots dos al·lels són normals. Herència: el fill ha rebut el 18 del pare i el 20 de la mare; la filla, el 42 del pare i el 22 de la mare. La mare no està afectada.
c) La mutació no és un canvi de base, sinó un canvi de longitud: el nombre de repeticions determina la mida del producte de PCR, i l'electroforesi separa els fragments per mida amb resolució de pocs parells de bases, amb un marcador adequat. Comparant amb el marcador es dedueix el nombre de repeticions sense llegir la seqüència; seqüenciar només caldria en casos límit (36–39 repeticions).
d) Motius per saber-ho: planificar la vida (feina, família), decidir si tenir fills i amb quines opcions (diagnòstic preimplantacional), participar en assajos clínics o en seguiments mèdics. Motius per no saber-ho: no hi ha cap tractament que canviï el curs de la malaltia, i conèixer un resultat positiu pot causar ansietat, depressió o discriminació (assegurances, feina); per això la prova predictiva només es fa en adults, de manera voluntària i amb assessorament genètic.

a) Els hidrocarburs són compostos orgànics rics en energia: alguns bacteris tenen enzims (oxigenases) que els oxiden i els fan servir com a font de carboni i d'energia, i els converteixen finalment en CO₂, aigua i biomassa. La degradació més ràpida és la respiració aeròbica: l'oxigen és l'acceptor final d'electrons i, a més, les oxigenases el necessiten per atacar la molècula; per això el petroli enterrat en sediments sense oxigen persisteix anys.
b) Per créixer, els bacteris necessiten fabricar proteïnes i àcids nucleics, i per això necessiten nitrogen i fòsfor en una proporció determinada respecte del carboni. Amb un excés enorme de carboni (petroli) i molt poc N i P a l'aigua de mar, aquests nutrients són el factor limitant: afegir-los permet que la població degradadora es multipliqui, i la degradació s'accelera.
c) La bioestimulació (1) aprofita els bacteris que ja hi viuen, adaptats al lloc, i només n'augmenta l'activitat; és senzilla i no introdueix organismes nous. La bioaugmentació (2) afegeix un bacteri especialitzat, que pot degradar components que els autòctons no ataquen, però sovint sobreviu malament en competència amb la flora local. Alliberar un organisme modificat planteja la possibilitat que persisteixi, es dispersi o transfereixi els plasmidis per conjugació a altres bacteris (transferència horitzontal), amb efectes impredictibles. Mesures: assajos confinats previs, seguiment, i «gens suïcides» o dependències nutritives que impedeixin que el bacteri sobrevisqui quan s'acabi el contaminant.
d) Els dispersants no eliminen el petroli: el fragmenten en gotes que es dilueixen a l'aigua, on poden ser tòxiques per al plàncton i els peixos, i ells mateixos són productes químics contaminants. La bioremediació mineralitza el petroli fins a CO₂ i aigua, no hi afegeix tòxics i aprofita processos naturals, però depèn del creixement dels bacteris (temperatura, oxigen, nutrients) i triga setmanes o mesos; per això sovint es combina amb la retirada física del gruix del vessament.

a) Parella correcta: (1) i (4). L'encebador (1) té la mateixa seqüència que l'inici de la cadena de dalt: s'aparella amb la cadena de baix i, en allargar-se pel 3', copia la regió cap a la dreta. L'encebador (4) és el complementari invers del final de la cadena de dalt (complementari de CTGGATCCAGTTGCATAGCA, escrit 5'→3'): s'aparella amb la cadena de dalt i s'allarga cap a l'esquerra. Els dos s'allarguen l'un cap a l'altre i delimiten els 480 pb.
L'encebador (2) és el complementari de l'inici: s'uniria a la cadena de dalt al principi de la regió, però s'allargaria cap a fora de la regió (cap a l'esquerra). L'encebador (3) és idèntic al final de la cadena de dalt: s'uniria a la cadena de baix i s'allargaria cap a la dreta, també fora. Amb (2) i (4) o amb (1) i (3), els dos encebadors s'allargarien en el mateix sentit i no hi hauria amplificació exponencial.
b) 100 %: 50 · $2^{30}$ = 50 · 1 073 741 824 ≈ 5,4·$10^{10}$ còpies. 90 %: 50 · 1,$9^{30}$ ≈ 1,2·$10^{10}$ còpies: una petita pèrdua d'eficiència per cicle redueix el resultat final unes 4,7 vegades, perquè l'efecte s'acumula exponencialment.
c) $2^{3}$ − 2 · 3 = 8 − 6 = 2 molècules de 480 pb. En el primer cicle, cada cadena original es copia des de l'encebador fins on arriba la polimerasa, més enllà de la regió: les cadenes noves tenen un extrem definit (el de l'encebador) i l'altre no. Només quan una d'aquestes cadenes noves fa de motlle (a partir del segon cicle) s'obtenen cadenes que acaben exactament a l'altre encebador, i les primeres molècules de doble cadena de mida exacta apareixen al tercer cicle. Després creixen exponencialment i, al cap de 30 cicles, són pràcticament totes ($2^{30}$ − 60).
d) És un control negatiu: si hi apareix producte, alguna cosa (els reactius, l'aigua, les puntes o l'ambient) està contaminada amb ADN de la regió, probablement de productes de PCR anteriors, i els resultats de les mostres no són fiables. Precaucions: preparar les reaccions en una zona separada d'on s'analitzen els productes, fer servir puntes amb filtre i guants, alíquotes dels reactius i repetir l'anàlisi amb reactius nous.

Errors típics

• Escriure l'encebador revers igual que el final de la cadena de dalt, sense fer-ne el complementari invers.
• Calcular les còpies com 50 · 30 · 2 (creixement lineal) en lloc de 50 · $2^{30}$.
• Pensar que des del primer cicle totes les molècules tenen la mida exacta del fragment.

Conceptes treballats: PCR i disseny d'encebadors; complementarietat i antiparal·lelisme de l'ADN; ADN polimerasa (síntesi 5'→3'); creixement exponencial; controls negatius

a) Cada al·lel d'un STR té un nombre diferent de repeticions d'un motiu curt (per exemple, AGAT repetit 12 vegades): els fragments amplificats per PCR tenen mides diferents i, com que l'ADN té càrrega negativa, migren cap al pol positiu a una velocitat que depèn de la mida (els petits avancen més). Són molt polimòrfics (molts al·lels a la població), i cada persona té una combinació de dos al·lels per locus: la combinació de molts loci és pràcticament única (llevat dels bessons idèntics).
b) Locus 1: 2 · 0,10 · 0,20 = 0,04. Locus 2: 0,$30^{2}$ = 0,09. Locus 3: 2 · 0,05 · 0,25 = 0,025. Locus 4: 2 · 0,15 · 0,10 = 0,03. Probabilitat del perfil = 0,04 · 0,09 · 0,025 · 0,03 = 2,7·10⁻⁶, és a dir, 1 de cada 370 370 persones.
c) 1,5·$10^{6}$ · 2,7·10⁻⁶ ≈ 4,05: s'esperen unes 4 persones amb el mateix perfil a la ciutat, a més de l'autor real. Si no hi ha cap altra prova, el sospitós seria un dels cinc possibles portadors del perfil, cosa molt diferent d'una seguretat de 369 999 entre 370 000. La frase confon la probabilitat que una persona a l'atzar coincideixi amb la probabilitat que el sospitós sigui innocent sabent que coincideix (és l'anomenada fal·làcia del fiscal). La coincidència és una prova forta, però s'ha d'avaluar juntament amb les altres.
d) Cada locus addicional multiplica la probabilitat per un factor petit (per exemple, 0,05): amb 20 loci la probabilitat d'una coincidència a l'atzar baixa a valors de l'ordre de 10⁻²⁰ o menys, i ja no s'espera cap coincidència entre tota la població mundial. Però el càlcul suposa persones no emparentades: els germans comparteixen al·lels perquè els hereten dels mateixos pares (a cada locus, $\tfrac{1}{4}$ de probabilitat de tenir els dos al·lels idèntics), de manera que la probabilitat que un germà coincideixi és molt més alta. Cal descartar els germans amb proves addicionals.

Errors típics

• Calcular la freqüència d'un heterozigot com p · q en lloc de 2pq.
• Sumar les probabilitats dels loci en lloc de multiplicar-les.
• Confondre la probabilitat de coincidència a l'atzar amb la probabilitat d'innocència.

Conceptes treballats: microsatèl·lits (STR), PCR i electroforesi; Hardy-Weinberg; probabilitat d'esdeveniments independents; aplicacions forenses de la biotecnologia; herència en germans

a) Totes les colònies de la placa tenen plasmidi, perquè l'ampicil·lina mata els bacteris sense plasmidi (el control 3 ho confirma). Si l'insert entra dins de lacZ, el gen queda interromput, no es fabrica l'enzim funcional i la colònia és blanca. Si el vector es torna a tancar sense insert, lacZ és intacte i la colònia és blava. Hi ha tantes colònies blaves perquè els dos extrems del mateix vector, que són a prop i són compatibles, es tornen a unir amb facilitat (autolligació) més sovint que no pas el vector capta un insert.
b) Total: 360 colònies. Blanques: $\tfrac{60}{360} \approx 16{,}7$ %. Segons la PCR, 4 de cada 6 blanques tenen insert (1,7 kb = 1,5 kb d'insert + 0,2 kb de vector): 60 · $\tfrac{4}{6} = 40$ colònies, és a dir, $\tfrac{40}{360} \approx 11{,}1$ % del total.
c) Colònies blanques sense insert: el vector pot haver perdut o guanyat uns quants nucleòtids als extrems del tall (per exemple, per degradació dels extrems abans de la lligació) i, en tornar-se a tancar, lacZ queda amb un desplaçament de la pauta de lectura: no es fabrica l'enzim, i la colònia és blanca tot i no tenir insert. Colonietes petites: són colònies satèl·lit. Els bacteris amb plasmidi fabriquen β-lactamasa, que surt de la cèl·lula i degrada l'ampicil·lina al voltant de la colònia; en aquesta zona hi poden créixer bacteris sense plasmidi. Com que no tenen el plasmidi (ni l'insert), no serveixen; a més, si es posen en medi amb ampicil·lina, moriran. S'eviten no allargant la incubació i fent servir plaques fresques.
d) La lligasa uneix un extrem 3'-OH amb un extrem 5'-fosfat. Si es treuen els fosfats 5' del vector, els seus dos extrems no es poden unir entre si i el vector no es pot tancar sol. L'insert, que no s'ha tractat, conserva els seus fosfats 5': cada unió vector-insert té un fosfat disponible en una de les cadenes i es pot formar. Queda una mossa (un enllaç sense formar) a cada cadena, que els bacteris reparen després de la transformació.

Errors típics

• Pensar que les colònies blaves no tenen plasmidi.
• Suposar que totes les colònies blanques tenen l'insert: cal comprovar-ho (PCR o digestió).
• Creure que la fosfatasa també impedeix la unió amb l'insert.

Conceptes treballats: vectors de clonació i ADN recombinant; selecció amb antibiòtics; cribratge blau/blanc (inactivació de lacZ); PCR de colònies; ADN lligasa i enllaç fosfodièster

a) La PCR fa servir una ADN polimerasa que necessita un motlle d'ADN. La transcriptasa inversa (un enzim dels retrovirus) copia l'ARNm a ADN complementari (ADNc). L'oligo-dT s'aparella amb la cua de poli-A dels ARNm madurs i fa d'encebador: així es copien només els ARNm (no els ARNr ni els ARNt) i en la seva forma madura, sense introns.
b) Sense transcriptasa inversa no hi pot haver ADNc: la banda ve d'ADN genòmic que ha contaminat l'extracció d'ARN. La seva mida ho confirma: 250 + 900 = 1150 pb, el fragment amb l'intró inclòs. Com que els encebadors són en exons diferents, el producte de l'ADNc (250 pb) i el de l'ADN genòmic (1150 pb) es distingeixen per la mida, i la contaminació no es confon amb l'expressió del gen.
c) ΔCt del fetge = 22 − 18 = 4. ΔCt del múscul = 28 − 18 = 10. ΔΔCt = 10 − 4 = 6. Diferència d'expressió = $2^{6}$ = 64: al fetge hi ha 64 vegades més ARNm de X que al múscul. El gen de referència serveix per corregir diferències en la quantitat d'ARN de partida. La PCR convencional s'analitza al final de la reacció: al múscul, amb 64 vegades menys motlle, el producte pot no arribar a ser visible al gel amb els cicles fets, mentre que la qPCR detecta el moment en què apareix el producte i és molt més sensible i quantitativa.
d) Totes les cèl·lules somàtiques tenen el mateix genoma; la diferència és en quins gens es transcriuen. Al fetge hi ha factors de transcripció específics que s'uneixen a seqüències reguladores (potenciadors) del gen X i n'activen la transcripció; al múscul aquests factors falten o hi ha repressors. També hi intervenen mecanismes epigenètics (metilació de l'ADN, modificacions de les histones que compacten o obren la cromatina) i postranscripcionals (estabilitat de l'ARNm, microARN).

Errors típics

• Pensar que la Taq polimerasa pot copiar directament l'ARN.
• Interpretar la banda del control sense transcriptasa com a expressió del gen.
• Oblidar que un Ct més alt vol dir menys motlle inicial, i calcular la diferència com $\tfrac{28}{22}$.

Conceptes treballats: transcriptasa inversa i ADNc; introns, exons i maduració de l'ARNm; PCR i PCR quantitativa; controls; regulació de l'expressió gènica i diferenciació cel·lular

a) Seqüències NGG: TGG als nucleòtids 2-4, CGG als nucleòtids 17-19 i TGG als nucleòtids 40-42. Cas9 necessita 20 nucleòtids just abans de la PAM perquè s'hi aparelli la guia: davant de la primera només n'hi ha 1, i davant de la segona, 16. L'única utilitzable és la TGG 40-42, que té 39 nucleòtids al davant.
b) Els 20 nucleòtids són el 20-39: ATCTGAAGCTTATCGCAGAG. ARN guia: 5'-AUCUGAAGCUUAUCGCAGAG-3' (més la part estructural que s'uneix a Cas9). El tall és 3 nucleòtids abans de la PAM, entre el nucleòtid 36 i el 37. Els codons són 1-3 (ATG), 4-6… el codó 12 ocupa els nucleòtids 34-36 (GCA) i el 13, els 37-39 (GAG): el tall queda entre el codó 12 i el 13.
c) Si es perd 1 nucleòtid, a partir del codó 13 es desplaça la pauta de lectura: tots els codons següents canvien, s'incorporen aminoàcids incorrectes i normalment apareix aviat un codó d'aturada prematur; la proteïna és curta i no funcional (gen inactivat). Si se'n perden 3, es perd un sol aminoàcid (el Glu del codó 13, si s'elimina GAG) i la resta de la proteïna és igual: pot conservar la funció. Si la mida és a l'atzar, 2 de cada 3 indels no són múltiples de 3: unes $\tfrac{2}{3}$ de les reparacions provocaran desplaçament de la pauta.
d) Cal afegir un ADN motlle (donador) amb la seqüència correcta i braços homòlegs a les dues bandes del tall: la cèl·lula pot fer servir aquest motlle per reparar per recombinació homòloga i incorporar-hi la seqüència correcta. Risc: l'ARN guia pot aparellar-se amb altres regions del genoma de seqüència semblant (amb 1-3 diferències) seguides d'una PAM, i Cas9 hi pot tallar (talls fora de diana), cosa que pot inactivar altres gens. Per això es trien guies amb una seqüència única al genoma i es comprova el resultat seqüenciant.

Errors típics

• Triar una PAM sense comprovar que hi ha 20 nucleòtids al davant.
• Escriure la guia complementària de la cadena on és la PAM: té la seva mateixa seqüència.
• Pensar que qualsevol deleció inactiva el gen: les de múltiples de 3 mantenen la pauta.

Conceptes treballats: edició genètica CRISPR-Cas9; seqüència PAM i ARN guia; codi genètic i pauta de lectura; mutacions per desplaçament de la pauta; reparació de l'ADN i recombinació homòloga

a) Eficiència = 25 / 5,0·10⁴ = 5·10⁻⁴ = 0,05 %. Totes les cèl·lules tenen el mateix genoma; un fibroblast és un fibroblast perquè expressa un conjunt de gens i en té d'altres silenciats (per factors de transcripció i marques epigenètiques). Els factors introduïts activen la xarxa de gens propis de les cèl·lules embrionàries pluripotents i, a poc a poc, es reorganitza la cromatina; la baixa eficiència indica que aquest «esborrat» epigenètic és difícil i només s'aconsegueix en poques cèl·lules.
b) Les cèl·lules iPS són humanes: un ratolí amb sistema immunitari normal les rebutjaria abans de veure què formen. Que formin un teratoma amb teixits de l'ectoderma, el mesoderma i l'endoderma demostra que poden diferenciar-se en cèl·lules de tots tres llinatges, és a dir, que són pluripotents.
c) Les iPS provenen del mateix pacient: tenen les seves molècules HLA i, en principi, no les rebutjaria (trasplantament autòleg); les cèl·lules mare embrionàries provenen d'un altre individu i podrien ser rebutjades. Èticament, les iPS no requereixen destruir embrions, mentre que les embrionàries s'obtenen de la massa cel·lular interna de blastocists, cosa que planteja un debat sobre l'estatus de l'embrió.
d) 1) El vector víric pot integrar-se al genoma i alterar gens (per exemple, activar un oncogèn o inactivar un gen supressor de tumors). 2) c-Myc és un oncogèn: si continua actiu, pot provocar divisió descontrolada. A més, si queden cèl·lules pluripotents no diferenciades entre les neurones, poden formar teratomes al cervell. Solucions: fer servir mètodes sense integració (ARN, proteïnes o vectors que no s'integren, i que es perden), evitar c-Myc o substituir-lo, i purificar les neurones abans del trasplantament per eliminar les cèl·lules indiferenciades. Si el Parkinson del pacient té una causa genètica, les neurones derivades de les seves cèl·lules portaran la mateixa mutació i podrien tornar a degenerar; caldria corregir-la abans (per exemple, amb edició genètica).

Errors típics

• Pensar que la reprogramació canvia la seqüència del genoma del fibroblast.
• Creure que el teratoma és un fracàs de l'experiment: en aquest test és la prova de pluripotència.
• Suposar que les cèl·lules autòlogues no tenen cap risc.

Conceptes treballats: cèl·lules mare pluripotents induïdes; diferenciació cel·lular i regulació gènica; vectors vírics; oncogens i càncer; rebuig immunitari; bioètica

a) A és ex vivo (les cèl·lules es modifiquen fora del cos i s'hi tornen), i B és in vivo (el vector s'injecta directament al teixit). Les cèl·lules mare de la medul·la es divideixen contínuament per produir totes les cèl·lules de la sang: el gen ha d'integrar-se al genoma perquè es copiï a cada divisió i passi a totes les cèl·lules filles durant tota la vida. Les cèl·lules de la retina (fotoreceptors) no es divideixen: un ADN que no s'integra (AAV) s'hi manté molt de temps i s'expressa, sense el risc d'alterar el genoma per integració.
b) Probabilitat per integració = 3·$\tfrac{10^{6}}{3}$·$10^{9}$ = 10⁻³. Cèl·lules amb una integració perillosa = $10^{8}$ · 10⁻³ = $10^{5}$.
c) Tot i que només 1 de cada 1000 cèl·lules té una integració perillosa, se'n tracten tantes que n'hi ha unes 100 000; n'hi ha prou que una adquireixi altres mutacions i proliferi sense control per originar una leucèmia. Millores: fer servir vectors que tendeixin a integrar-se lluny dels promotors dels gens (per exemple, derivats de lentivirus «autoinactivants», sense els potenciadors vírics forts), dirigir la inserció a un lloc segur del genoma amb edició genètica, o reduir el nombre de cèl·lules tractades i seguir el pacient per detectar clons anòmals.
d) En les dues estratègies es modifiquen cèl·lules somàtiques (de la sang o de la retina); les cèl·lules de la línia germinal (que formen els gàmetes) continuen tenint l'al·lel mutat, i el pacient el pot transmetre. Modificar cèl·lules germinals o embrions faria que el canvi passés a totes les generacions següents, sense el consentiment de les persones afectades, amb riscos (talls o integracions fora de diana) que no es poden avaluar a llarg termini, i obriria la porta a modificacions no terapèutiques; per això està prohibida per la legislació i els convenis internacionals.

Errors típics

• Pensar que un vector que no s'integra serveix igual per a cèl·lules que es divideixen.
• Dir que la teràpia gènica somàtica cura la malaltia també en la descendència.
• Menysprear un risc petit per cèl·lula sense tenir en compte el nombre de cèl·lules tractades.

Conceptes treballats: teràpia gènica ex vivo i in vivo; vectors vírics integratius i no integratius; mutagènesi per inserció i oncogens; cèl·lules somàtiques i germinals; bioètica

a) rr = q² = (0,001)² = 10⁻⁶. Al camp Bt: 8·10⁵ · 10⁻⁶ = 0,8 erugues rr; de mitjana, menys d'una. Totes sobreviuen (són resistents); la resta mor.
b) Supervivents: 2·10⁵ del refugi (amb q = 0,001) i 0,8 rr del camp Bt. Al·lels r = 2·10⁵ · 2 · 0,001 + 0,8 · 2 = 400 + 1,6 = 401,6. Al·lels totals = 2 · (2·10⁵ + 0,8) = 400 001,6. q = 401,6 / 400 001,6 ≈ 0,001004: pràcticament no canvia. Els rr que sobreviuen al camp Bt s'aparellen sobretot amb arnes RR del refugi, i els fills Rr moren al camp Bt. Sense refugi, només sobreviurien els rr: els pocs supervivents serien tots resistents (q = 1 entre els supervivents) i la població resistent es formaria en molt poques generacions.
c) Heterozigots al camp Bt: 8·10⁵ · 2 · 0,999 · 0,001 ≈ 1598,4, que ara sobreviuen. Al·lels r = 400 (refugi) + 1598,4 (heterozigots) + 1,6 (rr) = 2000. Al·lels totals = 2 · (2·10⁵ + 1598,4 + 0,8) = 403 198,4. q ≈ 0,00496, unes 5 vegades més que a la generació anterior: la resistència s'escamparia ràpidament malgrat el refugi. L'estratègia només funciona si la resistència és recessiva (o si la dosi de toxina és prou alta per matar els heterozigots), si l'al·lel és rar i si hi ha prou adults del refugi perquè els resistents s'hi aparellin.
d) Riscos: efecte de la toxina sobre insectes no diana (pol·linitzadors, papallones protegides o depredadors de la plaga), flux del transgèn per pol·len cap a varietats convencionals o ecològiques i parents silvestres, i acumulació de la toxina al sòl. Benefici: es redueix l'ús d'insecticides d'ampli espectre, que maten també insectes beneficiosos i contaminen el sòl i l'aigua.

Errors típics

• Oblidar que al refugi sobreviuen també els al·lels r dels heterozigots.
• Calcular la freqüència d'al·lels comptant individus en lloc de còpies de l'al·lel.
• Pensar que la toxina Bt provoca les mutacions de resistència.

Conceptes treballats: organismes transgènics; Hardy-Weinberg; selecció natural i resistència; dominància i recessivitat; avaluació de riscos ambientals

a) Al·lel normal: talls a 100 i 400 → 100 + 300 + 200 pb. Al·lel mutant: només talla a 100 → 100 + 500 pb. Homozigot normal: 300, 200 i 100. Heterozigot: 500, 300, 200 i 100. Homozigot mutant: 500 i 100. Pare i mare: heterozigots (portadors sans), coherent amb tenir una filla afectada. Filla: homozigota mutant (afectada). Fetus: homozigot normal (no afectat i no portador).
b) Aa × Aa → 1/4 AA, 1/2 Aa, 1/4 aa. Probabilitat d'estar afectat: 1/4; de ser portador: 1/2. Si se sap que no està afectat, només queden AA (1/4) i Aa (1/2): P(portador) = (1/2)/(3/4) = 2/3.
c) És un control intern de la digestió: com que tots els al·lels tenen aquest lloc, el fragment de 600 pb ha de desaparèixer sempre. Si apareix una banda de 600 pb, la digestió ha estat incompleta. A l'altre pacient, la banda de 600 pb indica que una part de l'ADN no s'ha tallat; la banda de 500 pb que esperaríem si fos heterozigot no apareix, però, si la digestió és incompleta, no es pot assegurar si hi ha molècules de l'al·lel mutant (500 pb) amagades o no: el resultat no és fiable i cal repetir la digestió (més enzim o més temps).
d) Els enzims de restricció només reconeixen seqüències concretes: si la mutació no altera cap diana, els dos al·lels donen les mateixes bandes. Alternatives: seqüenciar directament el fragment amplificat, fer una PCR amb encebadors específics de cada al·lel (que només s'allarguen si el seu extrem 3' és complementari de la base mutada o de la normal) o fer servir sondes marcades específiques de cada al·lel.

Errors típics

• Oblidar que el lloc constant també talla i donar 300 i 300 pb o 600 pb per a l'al·lel normal.
• Dir que la probabilitat que un fill sa de dos portadors sigui portador és 1/2 en lloc de 2/3.
• Diagnosticar un genotip a partir d'una digestió incompleta.

Conceptes treballats: diagnòstic genètic per PCR i enzims de restricció; electroforesi; herència autosòmica recessiva; probabilitat condicionada; controls interns; diagnòstic prenatal

a) 0,05·2ⁿ = 0,60 → 2ⁿ = 12 → n = log₂ 12 = 3,58 generacions → 3,58·30 min = 107,5 min (≈ 1 h 48 min).
b) Cèl·lules = 0,60·8,0·$10^{8}$ cèl·lules/mL·10,0·$10^{3}$ mL = 4,8·$10^{12}$ cèl·lules. Molècules de hGH = 4,8·$10^{12}$·2,0·$10^{6}$ = 9,6·$10^{18}$; mols = 9,6·$\tfrac{10^{18}}{6{,}022}$·$10^{23}$ = 1,59·$10^{-5}$ mol; massa = 1,59·$10^{-5}$·22 125 = 0,353 g = 353 mg.
c) 353 mg·0,40 = 141 mg → 141 dosis d'1,0 mg per lot.
d) L'IPTG és un anàleg no hidrolitzable de l'al·lolactosa: s'uneix al repressor Lac i el desprèn de l'operador, de manera que l'ARN polimerasa pot transcriure el cDNA de la hGH (l'ARNm es tradueix després als ribosomes bacterians). S'indueix quan ja hi ha prou biomassa perquè fabricar una proteïna forana és una càrrega metabòlica: si s'activés des del principi, les cèl·lules creixerien més lentament, el cultiu tardaria més i es seleccionarien les cèl·lules que perden o inactiven el plasmidi.
e) Fracció amb plasmidi = 0,98^3,58 = 93,0 %; massa = 353·0,930 = 328 mg (un 7 % menys). Després de 20 generacions sense antibiòtic, 0,$98^{20}$ = 66,8 %, i la producció cauria a uns 236 mg (un terç menys). Amb ampicil·lina, les cèl·lules que perden el plasmidi perden també el gen de resistència (la β-lactamasa) i moren, perquè l'antibiòtic impedeix que sintetitzin la paret bacteriana quan es divideixen: només creixen les que conserven el plasmidi i, amb ell, el gen de la hGH.

Errors típics

• Dividir el temps entre 30 min sense passar pel logaritme: la DO no creix linealment, es duplica a cada generació.
• Oblidar de passar els 10,0 L a mL abans de multiplicar per cèl·lules/mL.
• Dir que l'IPTG és el substrat de l'operó o que «és el gen de la hGH»: és un inductor que inactiva el repressor.
• Pensar que l'ampicil·lina «ajuda» a fabricar la proteïna: només selecciona les cèl·lules que tenen el plasmidi.

Conceptes treballats: producció de proteïnes recombinants en bacteris, creixement exponencial i temps de duplicació, regulació de l'operó lac i inductors, plasmidis i marcadors de selecció, antibiòtics β-lactàmics, càlculs de mols i massa.