Exercicis de genètica molecular — Biologia 2n Batxillerat

Cada molècula conserva una cadena de la mare, de manera que les dues cadenes pesants originals no es perden mai: sempre hi haurà exactament 2 molècules híbrides, i la resta seran lleugeres. Després de 1 generació: 2 molècules, totes dues híbrides (100 %). Després de 2: 4 molècules, 2 híbrides i 2 lleugeres (50 % i 50 %). Després de 3: 8 molècules, 2 híbrides i 6 lleugeres (25 % i 75 %). En un tub de centrifugació en gradient de densitat es veurien, doncs, una banda intermèdia i una de lleugera, i la lleugera cada cop més gruixuda. Si la replicació fos conservativa, no hi hauria mai cap banda intermèdia.

AUG codifica la metionina. A més de codificar aquest aminoàcid, AUG és el codó d'inici: marca el punt exacte on el ribosoma comença a llegir l'ARN missatger de tres en tres bases.

Una mutació canvia la seqüència de bases de l'ADN (n'altera la informació genètica). Una marca epigenètica no canvia cap base: només modifica si un gen es pot transcriure o no (per exemple, metilant l'ADN o modificant les histones), deixant la seqüència genètica intacta.

Regla de Chargaff: en el DNA bicatenari, A s'aparella amb T i G amb C, de manera que A = T i G = C.
Timina: T = A = 30 %.
Guanina i citosina: G + C = 100 - (30 + 30) = 40 %, i com que G = C, cadascuna és del 20 %.
Comprovació: 30 + 30 + 20 + 20 = 100 %, i (A + G)/(T + C) = 50/50 = 1, com correspon a un DNA de doble cadena.
Error típic: aplicar A = T i G = C a un RNA o a un DNA monocatenari, on la regla no es compleix perquè les bases no estan aparellades.

Llegim el mRNA de tres en tres bases, en sentit 5' → 3', començant pel codó d'inici AUG: AUG · GCU · UUU · GAA · UAG.
AUG → Met; GCU → Ala; UUU → Phe; GAA → Glu; UAG → aturada (no codifica cap aminoàcid: el ribosoma allibera el pèptid).
Pèptid: Met-Ala-Phe-Glu, de 4 aminoàcids.
Error típic: comptar el codó d'aturada com un aminoàcid més; 5 codons donen 4 aminoàcids.

Helicasa → (3): obre la doble hèlix trencant els ponts d'hidrogen entre les bases complementàries.
Primasa → (1): fabrica l'encebador de RNA que aporta l'extrem 3'-OH lliure que necessita la DNA polimerasa per començar.
DNA polimerasa → (4): allarga la cadena nova només en sentit 5' → 3' i, a més, corregeix els errors d'aparellament.
DNA lligasa → (2): segella els talls entre els fragments d'Okazaki de la cadena retardada.
Topoisomerasa → (5): fa talls transitoris que relaxen el superenrotllament generat per l'obertura de la forquilla.

a) Certa. Hi ha 64 codons per a només 20 aminoàcids (i 3 senyals d'aturada); per exemple, la leucina té sis codons. Aquesta redundància fa que moltes substitucions de la tercera base siguin silencioses.
b) Falsa. El codi no és ambigu: cada codó codifica sempre un únic aminoàcid (o una aturada), sigui quina sigui la cèl·lula. No s'ha de confondre degenerat (molts codons → un aminoàcid) amb ambigu (un codó → molts aminoàcids).
c) Certa. El codi és gairebé universal, amb poques excepcions (per exemple, alguns codons dels mitocondris). Aquesta universalitat és el que permet que un bacteri fabriqui una proteïna humana com la insulina a partir d'un gen humà.

L'anticodó s'aparella amb el codó de manera complementària i antiparal·lela: G-C, C-G, A-U.
Codó 5'-GCA-3' → anticodó 3'-CGU-5' (escrit en el sentit habitual 5' → 3' és 5'-UGC-3').
El tRNA ha de portar unida al seu extrem 3' (seqüència CCA) una alanina: l'aminoacil-tRNA sintetasa és l'enzim que garanteix que cada tRNA carregui l'aminoàcid que correspon al seu anticodó.
Error típic: escriure l'anticodó 5'-CGU-3' sense tenir en compte que codó i anticodó són antiparal·lels.

En la maduració (splicing) s'eliminen els introns i s'uneixen els exons; els introns no arriben al mRNA madur.
Nucleòtids codificants: 150 + 90 + 240 = 480 nucleòtids.
Codons: $\tfrac{480}{3} = 160$ codons.
Aminoàcids: 160 - 1 = 159, perquè el codó d'aturada no codifica cap aminoàcid (la metionina inicial sí que es compta).
Comprovació: 480 és múltiple de 3, de manera que el marc de lectura és complet.
Error típic: sumar també els introns (480 + 1700 = 2180 nucleòtids), que no formen part del mRNA madur.

Lloc: en els procariotes la transcripció passa al citoplasma, perquè no tenen nucli; en els eucariotes passa dins del nucli i el mRNA ha de sortir pels porus nuclears.
Maduració: el mRNA procariota es tradueix tal com surt, sense modificacions; el mRNA eucariota madura abans de sortir del nucli: rep una caputxa a l'extrem 5', una cua poli-A a l'extrem 3' i perd els introns (splicing).
Acoblament: en els procariotes transcripció i traducció són simultànies (els ribosomes s'uneixen al mRNA mentre encara s'està transcrivint); en els eucariotes són processos separats en l'espai i en el temps.
Una altra diferència: els mRNA procariotes solen ser policistrònics (operons) i els eucariotes, monocistrònics.

Aparellem cada base (A amb T, G amb C): l'A dona T, l'A dona T, la G dona C, la C dona G, la T dona A i la G dona C.
La cadena complementària és T-T-C-G-A-C.

Aparellem cada base amb la seva complementària, posant U en lloc de T: la T dona A, l'A dona U, la C dona G, la G dona C, la G dona C i l'A dona U.
L'ARN missatger és A-U-G-C-C-U.

Que li permet regular-los TOTS ALHORA amb un sol interruptor. Els enzims d'una via es necessiten sempre junts i en el mateix moment: si el substrat apareix al medi calen tots, i si no hi és no en cal cap. Agrupats sota un únic promotor, un sol senyal (la unió o la retirada del repressor a l'operador) encén o apaga la via sencera de cop, de manera coordinada i en proporcions equilibrades. Si cada gen tingués el seu promotor, la cèl·lula hauria de regular-los un per un i s'arriscaria a fabricar-ne uns i altres no, cosa que deixaria la via incompleta. És, doncs, un mecanisme d'estalvi i de coordinació.

Intervenen DIRECTAMENT en la síntesi de proteïnes: el mRNA, que porta la còpia de la informació d'un gen des de l'ADN fins al ribosoma; el tRNA, que transporta els aminoàcids i els col·loca en l'ordre correcte aparellant el seu anticodó amb el codó del mRNA; i el rRNA, que forma l'estructura del ribosoma i catalitza la formació de l'enllaç peptídic. Té funció REGULADORA el miRNA: no es tradueix, sinó que s'uneix per complementarietat a un mRNA concret i n'impedeix la traducció o el fa degradar. La diferència de fons: els tres primers són maquinària de fabricació, el quart és un interruptor.

Original: AUG·AAA·GGU·UGG·UAA → Met-Lys-Gly-Trp (aturada).
a) AUG·AAG·GGU·UGG·UAA → Met-Lys-Gly-Trp: el codó AAA ha passat a AAG, però tots dos codifiquen lisina. Mutació silenciosa (gràcies a la degeneració del codi).
b) AUG·AAA·GAU·UGG·UAA → Met-Lys-Asp-Trp: GGU (Gly) ha passat a GAU (Asp). Mutació de canvi de sentit: canvia un aminoàcid i pot alterar la funció de la proteïna.
c) AUG·AAA·GGU·UGA·UAA → Met-Lys-Gly: UGG (Trp) s'ha convertit en UGA, un codó d'aturada prematur. Mutació sense sentit: la proteïna queda truncada i normalment no és funcional.
Totes tres són substitucions d'una sola base, però l'efecte depèn del codó que en resulta.

Sense el quart nucleòtid la seqüència queda 5'-AUGUUGGUAAAUGG-3' i es llegeix AUG·UUG·GUA·AAU·GG.
Pèptid mutant: Met-Leu-Val-Asn (els dos últims nucleòtids, GG, no formen un codó complet; en el gen real la lectura continuaria desplaçada fins a trobar un codó d'aturada).
La deleció desplaça el marc de lectura: a partir del punt de la mutació tots els codons canvien, i la proteïna té una seqüència totalment diferent, sovint amb un codó d'aturada prematur.
Una substitució només afecta un codó: pot ser silenciosa, canviar un sol aminoàcid o crear una aturada, però la resta de la proteïna es manté.
Per això les insercions i delecions que no són múltiples de 3 nucleòtids (mutacions de canvi de marc) acostumen a inactivar completament la proteïna.

a) Sense lactosa: el gen regulador produeix el repressor, que és actiu i s'uneix a l'operador. L'operador es troba entre el promotor i els gens estructurals, de manera que bloqueja el pas de la RNA polimerasa: els gens (lacZ, lacY i lacA) no es transcriuen i no es fabriquen els enzims.
b) Amb lactosa i sense glucosa: una part de la lactosa es converteix en al·lolactosa (l'inductor), que s'uneix al repressor i li canvia la conformació; el repressor ja no pot unir-se a l'operador. La RNA polimerasa transcriu els gens estructurals en un sol mRNA policistrònic i el bacteri fabrica la beta-galactosidasa i la permeasa. A més, l'absència de glucosa fa augmentar l'AMPc, que amb la proteïna CAP estimula encara més la transcripció.
És un operó induïble perquè normalment està apagat i només s'encén (s'indueix) quan apareix el substrat: el bacteri només inverteix energia a fabricar els enzims quan hi ha lactosa per digerir.

La DNA polimerasa només pot afegir nucleòtids a un extrem 3'-OH, és a dir, sintetitza sempre en sentit 5' → 3', i les dues cadenes del DNA són antiparal·leles.
La cadena nova que creix en el mateix sentit en què avança la forquilla (cadena conductora o líder) es pot sintetitzar de manera contínua amb un sol encebador.
L'altra cadena nova hauria de créixer en sentit contrari a l'avanç de la forquilla; per això es fa a trossos, els fragments d'Okazaki, a mesura que la forquilla va descobrint motlle nou. És la cadena retardada.
Per a cada fragment, la primasa sintetitza un encebador de RNA, la DNA polimerasa l'allarga, després s'eliminen els encebadors i s'omplen els buits amb DNA, i la DNA lligasa uneix els fragments.
Les dues cadenes es repliquen alhora, però la retardada va una mica endarrerida respecte de la conductora.

a) Cada codó són 3 parells de bases: $\tfrac{1200}{3} = 400$ codons. El codó d'aturada no codifica cap aminoàcid, de manera que la proteïna té com a màxim 400 - 1 = 399 aminoàcids (la metionina inicial sí que es compta).
b) Longitud: 1200 pb · 0,34 nm/pb = 408 nm (0,408 µm).
c) Voltes: 1200 pb / 10 pb per volta = 120 voltes d'hèlix.
Comprovació: 120 voltes · 3,4 nm per volta = 408 nm, el mateix resultat de l'apartat b.

El sofre forma part de les proteïnes (aminoàcids cisteïna i metionina) i no del DNA; el fòsfor forma part dels nucleòtids del DNA (grups fosfat) i no de les proteïnes. Per tant, el ³⁵S marca la càpsida proteica i el ³²P marca el DNA del fag.
Amb l'agitació es desprenen les càpsides que han quedat a l'exterior del bacteri; en centrifugar, els bacteris van al sediment i les càpsides queden al sobrenedant.
Resultat: la radioactivitat del ³²P va aparèixer al sediment (dins dels bacteris) i es va transmetre als fags descendents; la del ³⁵S es va quedar al sobrenedant.
Conclusió: el que el virus injecta al bacteri per fabricar nous virus és el DNA, no la proteïna: el DNA és el portador de la informació genètica.

L'alumne ha fet la complementària de la cadena codificant, com si fos la cadena motlle (i a més l'ha escrita amb la polaritat invertida).
La cadena motlle és la que llegeix la RNA polimerasa (en sentit 3' → 5') per fabricar un mRNA complementari; aquí és 3'-TACCGGATT-5'.
La cadena codificant és l'altra: té la mateixa seqüència i polaritat que el mRNA, amb T en lloc de U; per això se'n diu codificant i és la que s'escriu als bancs de dades.
mRNA correcte: 5'-AUGGCCUAA-3' (es llegeix AUG = Met, GCC = Ala, UAA = aturada).
Comprovació: el mRNA ha de començar pel codó d'inici AUG; el de l'alumne començava per UAC, cosa que ja delatava l'error.

(a) Totes les cèl·lules tenen el mateix DNA, però cada tipus cel·lular n'expressa només una part: la regulació de l'expressió gènica.
(b) Els factors de transcripció, que són proteïnes, s'uneixen al promotor i a seqüències reguladores com els potenciadors, i fan que la RNA polimerasa transcrigui el gen o no. Cada tipus de cèl·lula té el seu conjunt de factors de transcripció actius.
(c) El gen de la insulina es transcriuria molt menys, encara que la seva seqüència codificant fos normal, i les cèl·lules beta fabricarien poca insulina.

(a) La PCR amplifica exponencialment un FRAGMENT DE DNA concret: en poques hores en fa milions de còpies a partir d'una quantitat mínima. Per dissenyar-la cal conèixer la seqüència dels extrems del fragment que es vol copiar, per poder fabricar els encebadors que hi hibriden, i cal una DNA polimerasa resistent a la calor. (b) SÍ. Que el virus sigui latent vol dir que no s'està multiplicant activament ni causant símptomes, però el seu material genètic ÉS PRESENT dins de les cèl·lules de l'animal. La PCR detecta la presència del DNA, no l'activitat del virus, i per això és justament la tècnica adequada per trobar portadors asimptomàtics. (c) SÍ. Perquè el virus hi va entrar en algun moment i el sistema immunitari el va reconèixer aleshores: la resposta específica va generar anticossos i cèl·lules de memòria, que persisteixen encara que el virus estigui ara inactiu. De fet, trobar anticossos indica exposició passada, i trobar DNA víric indica que encara hi és: les dues proves són complementàries.

L'ordre és IV - II - I - V - III. Primer cal saber QUÈ es vol modificar: s'identifica el gen d'interès i se n'obté la seqüència (IV). Amb la seqüència a la mà es dissenya l'RNA GUIA, complementari de la regió diana (II). L'RNA guia és el que dona l'especificitat a tota la tècnica: la proteïna Cas9 per si sola no sap on tallar, i és l'aparellament de bases entre l'RNA guia i el DNA el que la porta exactament al punt volgut. Un cop guiat, el Cas9 talla la doble cadena en aquella posició (I). La cèl·lula detecta el tall i activa els seus mecanismes de reparació, i és aprofitant aquesta reparació que s'introdueix la modificació desitjada (V). Finalment es verifica per seqüenciació que el canvi hi és i que el gen s'expressa de manera funcional (III). Sense aquesta última comprovació no es pot afirmar que l'edició hagi funcionat.

a) La transformació és la captació, per part d'un bacteri, de DNA lliure del medi i la seva incorporació al genoma, de manera que el bacteri adquireix caràcters nous (aquí, la capacitat de fabricar càpsula i ser virulent).
b) Tub 1: l'extracte conté alguna molècula que converteix bacteris R en S. Tubs 2 i 3: la transformació es manté encara que s'hagin destruït les proteïnes o el RNA, de manera que cap d'aquestes molècules n'és la responsable. Tub 4: en destruir el DNA desapareix la transformació; per tant, el principi transformant és el DNA (experiment d'Avery, MacLeod i McCarty).
c) La proteasa degrada les proteïnes de l'extracte; si la informació per fabricar càpsula estigués en una proteïna, al tub 2 no hi hauria d'haver colònies S. Com que n'hi ha, les proteïnes no són el material genètic, tot i que en aquella època era la hipòtesi majoritària.
Control adequat: un tub només amb bacteris R vius, on no haurien d'aparèixer colònies S, per descartar mutacions espontànies.

a) Addició de la caputxa (7-metilguanosina) a l'extrem 5', que protegeix el mRNA i permet que el ribosoma el reconegui; addició de la cua poli-A (uns 200 nucleòtids d'adenina) a l'extrem 3', que l'estabilitza; i splicing o maduració per tall i unió, en què l'espliceosoma elimina els introns i uneix els exons.
b) Com que E2 i E3 són opcionals i independents, hi ha 2 · 2 = 4 combinacions: E1-E4, E1-E2-E4, E1-E3-E4 i E1-E2-E3-E4.
c) És el splicing alternatiu: un mateix gen dona lloc a diversos mRNA madurs i, per tant, a diverses proteïnes (isoformes) amb seqüències parcialment diferents, segons el teixit o el moment del desenvolupament. Així, el nombre de proteïnes pot ser molt superior al nombre de gens.
Les isoformes comparteixen els exons constants i es diferencien pels variables; per això una mutació a E1 afecta totes les isoformes, i una a E2 només les que l'inclouen.

(1) Promotor: la caixa TATA és on s'uneixen els factors de transcripció i la RNA polimerasa. La mutació no toca la regió codificant, de manera que la proteïna té la seqüència normal, però se'n transcriu menys mRNA: afecta la quantitat.
(2) Lloc de splicing: l'espliceosoma no reconeix l'intró, que es queda al mRNA madur, o bé se salta l'exó veí. La seqüència de la proteïna canvia (sovint amb canvi de marc i aturada prematura): afecta la seqüència, i la proteïna sol ser no funcional.
(3) Substitució silenciosa: GGC i GGU codifiquen glicina, de manera que la proteïna és idèntica i en quantitat normal: en principi no afecta res.
(4) Deleció de 3 nucleòtids: és múltiple de 3, així que no desplaça el marc de lectura; la proteïna perd un aminoàcid (o en canvia un i en perd un altre, si la deleció cau entre dos codons). Afecta la seqüència, i la gravetat depèn de si l'aminoàcid era important per a l'estructura o el centre actiu.
La més probablement inofensiva és la (3), gràcies a la degeneració del codi genètic.

a) Operó lac (induïble): el repressor és actiu per si sol i bloqueja l'operador; la lactosa (via al·lolactosa) és l'inductor que inactiva el repressor i encén la transcripció. Té sentit perquè els gens codifiquen enzims catabòlics, que només calen quan hi ha lactosa per degradar. Operó trp (repressible): el repressor és inactiu per si sol; el triptòfan fa de corepressor, s'hi uneix i l'activa perquè bloquegi l'operador. Té sentit perquè els gens codifiquen enzims de síntesi del triptòfan, que no cal fabricar quan ja n'hi ha prou.
b) Si el repressor no pot unir-se al triptòfan, mai no s'activa ni s'uneix a l'operador: els gens de síntesi es transcriuen contínuament (expressió constitutiva), encara que hi hagi molt triptòfan. El bacteri malgasta energia fabricant un aminoàcid que ja té.
c) Si el repressor lac no pot unir-se a l'operador, no pot bloquejar la RNA polimerasa: els gens lac es transcriuen contínuament, també sense lactosa (expressió constitutiva), i el bacteri fabrica enzims que no necessita.
En tots dos mutants es perd la regulació negativa i el resultat és el mateix, expressió permanent, però per causes diferents: un repressor que no s'activa i un repressor que no pot actuar.

a) La DNA polimerasa només allarga a partir d'un extrem 3'-OH preexistent, que en la cadena retardada aporta un encebador de RNA. Quan s'elimina l'últim encebador, el de l'extrem 5' de la cadena nova, no hi ha cap fragment anterior amb un 3'-OH des del qual omplir el buit, i aquell tros queda sense copiar: la cadena nova és més curta. En un cromosoma circular no hi ha extrems: sempre hi ha un fragment anterior que aporta el 3'-OH, i no es perd res.
b) La telomerasa allarga l'extrem 3' de la cadena motlle afegint-hi repeticions curtes (en humans, TTAGGG), de manera que després es pot sintetitzar la cadena complementària i compensar la pèrdua. És una ribonucleoproteïna: porta una petita molècula de RNA que li fa de motlle, així que funciona com una transcriptasa inversa. És activa en cèl·lules germinals, cèl·lules mare i la majoria de cèl·lules tumorals, però no en la majoria de cèl·lules somàtiques.
c) Sense telomerasa, els telòmers s'escurcen a cada divisió; quan són massa curts, la cèl·lula ho detecta com un dany al DNA i deixa de dividir-se (senescència) o entra en apoptosi. Això limita el nombre de divisions i explica per què la reactivació de la telomerasa afavoreix la immortalitat de les cèl·lules canceroses.

a) Amb l'inhibidor A el mRNA desapareix progressivament: no se'n fabrica de nou i el que hi havia es va degradant; per tant, A bloqueja la transcripció (la RNA polimerasa). Amb l'inhibidor B el mRNA es manté, i fins i tot augmenta una mica perquè es continua transcrivint, però la proteïna baixa: B bloqueja la traducció (els ribosomes).
b) Mentre queda mRNA, els ribosomes el continuen traduint i es continua fabricant proteïna; a més, la proteïna que ja existia es degrada lentament. Per això la proteïna només baixa clarament quan el mRNA ja ha disminuït molt: hi ha un retard entre els dos nivells.
c) Amb la transcripció aturada, el mRNA passa del 100 % al 50 % en 2 hores i al 25 % en 4 hores: cada 2 hores se'n degrada la meitat. La vida mitjana del mRNA de X és d'unes 2 hores.
Comprovació: 100 → 50 → 25 és una disminució a la meitat per cada interval de 2 h, coherent amb una degradació exponencial.

a) Generació 1: cada molècula conserva una cadena P i en sintetitza una L: 100 % híbrides (P/L), una sola banda intermèdia. Generació 2: les cadenes P donen P/L i les L donen L/L: 50 % híbrides i 50 % lleugeres. Generació 3: continuen havent-hi només dues cadenes P de les inicials, ara entre 8 molècules: 25 % híbrides i 75 % lleugeres.

b) El model conservatiu prediu a la generació 1 dues bandes (50 % P/P i 50 % L/L); una sola banda intermèdia el descarta. El model dispersiu prediu a la generació 1 també una banda intermèdia, però a la generació 2 hauria de donar una sola banda, més lleugera que la híbrida (cada molècula amb un 25 % de ¹⁵N); l'aparició de dues bandes (híbrida i lleugera) el descarta.

c) A la generació 2, de cada 4 cadenes, 1 és P i 3 són L (dues molècules: una P/L i una L/L). Al medi amb ¹⁵N, cada cadena s'emparella amb una cadena nova P: la cadena P dona P/P i les tres L donen P/L. Resultat: 25 % pesants (P/P) i 75 % híbrides (P/L), sense cap banda lleugera.

d) Semiconservatiu: les cadenes individuals són totalment P o totalment L: dues bandes de cadena senzilla, 25 % pesant i 75 % lleugera. Dispersiu: cada cadena seria un mosaic amb un 25 % de ¹⁵N: una sola banda intermèdia. Aquesta prova analitza directament les cadenes i demostra que cada cadena es conserva sencera, que és exactament el que afirma el model semiconservatiu.

Errors típics

• Pensar que a la generació 3 desapareix la banda híbrida: les dues cadenes pesants originals no es perden mai, només es dilueixen.
• Dir que la generació 1 ja descarta el model dispersiu.
• A l'apartat c), oblidar que les cadenes noves són ara pesants i predir una banda lleugera.

Conceptes treballats: replicació semiconservativa; experiment de Meselson i Stahl; disseny experimental i predicció de models alternatius; complementarietat de cadenes

a) ARNm 5'-GCAUGGCUAAAUGGUUCGAGUAAGC-3'
Motlle 3'-CGTACCGATTTACCAAGCTCATTCG-5' (complementària, antiparal·lela i amb T en lloc d'U).

b) Primer AUG (posicions 3-5): AUG GCU AAA UGG UUC GAG UAA → Met-Ala-Lys-Trp-Phe-Glu i aturada. Segon AUG (posicions 11-13): AUG GUU CGA GUA AGC → Met-Val-Arg-Val-Ser… sense aturada dins del fragment. El ribosoma eucariota s'uneix a la caputxa 5' i inicia al primer AUG que troba (model de rastreig), de manera que fa servir el primer marc. Per a aquest ribosoma, el segon AUG no és un codó: la seva A és l'última base del codó AAA (Lys) i les bases UG són les dues primeres del codó UGG (Trp). Una mateixa seqüència té significats diferents segons el marc de lectura, i per això és tan important l'inici correcte.

c) M1 (G13→A): UGG → UAG, codó d'aturada: Met-Ala-Lys, proteïna truncada (mutació sense sentit). M2 (U8→C): GCU → GCC, continua sent Ala: silenciosa (codi degenerat). M3 (deleció G6): AUG CUA AAU GGU UCG AGU AAG C… → Met-Leu-Asn-Gly-Ser-Ser-Lys…: canvien tots els aminoàcids a partir del segon i desapareix el codó d'aturada original (mutació de desplaçament del marc de lectura). M4 (G20→U): GAG → GAU: Glu → Asp, mutació de canvi de sentit, però conservadora (tots dos aminoàcids són àcids).

d) De menys a més greu: M2 (cap canvi), M4 (un aminoàcid similar; probablement poc efecte) i, finalment, M1 i M3. M1 i M3 són les més greus: M1 elimina tota la proteïna a partir del quart aminoàcid i M3 canvia tota la seqüència a partir del segon. En un gen complet, totes dues farien una proteïna no funcional (i sovint l'ARNm amb un codó d'aturada prematur es degrada).

Errors típics

• Escriure la cadena motlle amb la mateixa polaritat que l'ARNm o amb U.
• Començar a llegir des del primer nucleòtid del fragment en lloc del codó d'inici.
• Considerar que una substitució sempre canvia l'aminoàcid: cal mirar la degeneració del codi.

Conceptes treballats: transcripció i complementarietat antiparal·lela; inici de la traducció; marcs de lectura; codi genètic degenerat; tipus de mutacions puntuals i efecte en la proteïna

a) AUG GCU CAU GCC AUC GCU AAA GGC GAA UGG CCU UAA → Met-Ala-His-Ala-Ile-Ala-Lys-Gly-Glu-Trp-Pro i aturada.

b) Deleció del 5: AUG GUC AUG CCA UCG CUA AAG GCG AAU GGC CUU… → Met-Val-Met-Pro-Ser-Leu-Lys-Ala-Asn-Gly-Leu…: a partir del segon codó canvia tota la seqüència i el codó d'aturada original queda fora de marc. Doble mutant: AUG GUC AUG CCA UGC GCU AAA GGC GAA UGG CCU UAA → Met-Val-Met-Pro-Cys-Ala-Lys-Gly-Glu-Trp-Pro. Entre la deleció i la inserció el marc està desplaçat (4 aminoàcids canviats), però la inserció el restableix i la resta de la proteïna és normal. Com que aquesta regió no és essencial, la proteïna funciona: la inserció és una mutació supressora de la deleció.

c) Triple deleció: AUG GUC UGC AUC GCU AAA GGC GAA UGG CCU UAA → Met-Val-Cys-Ile-Ala-Lys-Gly-Glu-Trp-Pro: es perden 3 nucleòtids (un codó), la proteïna té un aminoàcid menys i dos de canviats, i a partir d'aquí el marc és el correcte. Doble deleció: AUG GUC UGC CAU CGC UAA → Met-Val-Cys-His-Arg i aturada prematura: amb dues delecions el marc queda desplaçat i apareix un codó d'aturada; proteïna truncada i no funcional.

d) 1) El codi és de triplets: només un nombre de delecions múltiple de 3 restableix el marc. 2) Es llegeix a partir d'un punt d'inici fix, de manera seguida i sense separacions («comes») entre codons: per això un sol nucleòtid de més o de menys desplaça tota la lectura posterior. 3) No és encavalcat: cada nucleòtid pertany a un sol codó, i per això els canvis queden limitats a la zona entre mutacions. (A més, que les seqüències desplaçades codifiquin aminoàcids i no s'aturin de seguida indica que el codi és degenerat: la majoria de triplets codifiquen algun aminoàcid.)

Errors típics

• Continuar llegint el marc original després de la deleció, com si només canviés un aminoàcid.
• Pensar que dues delecions properes es compensen com una deleció i una inserció.
• Confondre «sense comes» (lectura seguida) amb «no encavalcat» (cada nucleòtid en un sol codó).

Conceptes treballats: mutacions de desplaçament del marc de lectura; mutacions supressores; propietats del codi genètic; traducció; relació entre experiment i model

a) Una mutació puntual no canvia la mida d'un fragment d'ADN genòmic, que a més conté els introns (sovint de milers de parells de bases). L'efecte d'aquestes mutacions és sobre la maduració (splicing) del transcrit primari, i només es veu a l'ARNm. Per estudiar-lo cal passar l'ARNm a ADNc amb la transcriptasa inversa (RT) i amplificar-lo per PCR: la mida del producte reflecteix quins exons conté l'ARNm madur.

b) Pacient 1: 650 − 503 = 147 nt; pacient 2: 650 − 538 = 112 nt. El GT de l'inici d'un intró és el lloc donador d'splicing; si es destrueix, l'exó anterior no s'uneix correctament i s'acaba excloent de l'ARNm (salt d'exó). Per tant, al pacient 1 s'ha perdut l'exó 3 (147 nt) i al pacient 2, l'exó 4 (112 nt). La banda de 650 pb ve de l'al·lel normal, ja que tots dos pacients són heterozigots.

c) Pacient 1: 147 = 3 · 49, la deleció manté el marc de lectura. La proteïna perd 49 aminoàcids però la resta és idèntica. Pacient 2: 112 = 3 · 37 + 1, no és múltiple de 3: a partir de l'exó 5 es produeix un desplaçament del marc de lectura, canvia tota la seqüència posterior i normalment apareix un codó d'aturada prematur: proteïna truncada (i l'ARNm sovint es degrada).

d) Sí, és coherent. Al pacient 1 falta un bloc intern de 49 aminoàcids, però els dominis codificats pels altres exons es conserven i la proteïna pot mantenir part de l'estructura i la funció. Al pacient 2, la proteïna perd tota la part codificada pels exons 5 i 6 (per exemple, el domini transmembrana o un domini funcional) i no funciona. A més, en tots dos casos l'al·lel normal aporta una part de la proteïna funcional.

Errors típics

• Pensar que la mutació del GT de l'intró 3 afecta l'exó 4.
• Interpretar la banda de 650 pb com un error o com una contaminació, en lloc de l'al·lel normal d'un heterozigot.
• Suposar que qualsevol deleció d'un exó canvia tota la proteïna, sense comprovar si la mida és múltiple de 3.

Conceptes treballats: maduració de l'ARNm i splicing; exons i introns; RT-PCR i transcriptasa inversa; marc de lectura; heterozigosi; cas clínic

a) Sense lactosa, el repressor (producte de lacI) s'uneix a l'operador i impedeix que l'ARN polimerasa transcrigui els gens estructurals: activitat basal (1). Amb lactosa, l'alolactosa s'uneix al repressor, en canvia la conformació i el desenganxa de l'operador: es transcriu l'operó (100). És un operó induïble. Si hi ha glucosa, la concentració d'AMPc baixa, la proteïna CAP no s'hi uneix i l'ARN polimerasa s'uneix malament al promotor: l'activitat seria molt baixa encara que hi hagi lactosa (repressió catabòlica). La cèl·lula prioritza la glucosa, que no requereix fabricar enzims nous.

b) El F' aporta un repressor normal (lacI⁺). A la soca 2, el F' fa tornar induïble l'operó del cromosoma (1; 100): el defecte era la falta d'un repressor funcional, i el repressor del F' arriba per difusió a l'operador cromosòmic. La soca 2 és lacI⁻; la mutació és recessiva i el producte normal actua en trans (sobre una altra molècula d'ADN). A la soca 3, el F' no canvia res (100; 100): encara que hi hagi repressor normal, aquest no s'uneix a l'operador mutat del cromosoma, i els lacZ⁺ que hi ha al seu costat es transcriuen sempre. És lacO^c, una mutació que actua en cis: només afecta els gens de la mateixa molècula d'ADN.

c) Si la soca 4 fos lacZ⁻, el F' lacI⁺ lacO⁺ lacZ⁺ aportaria un operó normal i hi hauria activitat amb lactosa (1; 100). Com que continua sent 1; 1, la soca 4 és lacI^s: el seu repressor no uneix l'alolactosa i bloqueja els dos operadors (el del cromosoma i el del F'). És una mutació dominant que actua en trans.

d) El lacZ⁺ funcional és al cromosoma, amb un operador normal: és regulat pel repressor normal i serà induïble. L'operador constitutiu del F' només afecta el lacZ⁻ del seu costat, que no fa enzim actiu. Resultat: 1 sense lactosa i 100 amb lactosa.

Errors típics

• Pensar que un operador normal en un plasmidi pot «corregir» un operador mutat del cromosoma.
• Oblidar que la lactosa no actua directament sinó a través de l'alolactosa, que s'uneix al repressor.
• Creure que en presència de lactosa l'operó s'expressa al màxim encara que hi hagi glucosa.

Conceptes treballats: regulació gènica en procariotes; operó lac; repressor i operador; elements cis i factors trans; repressió catabòlica (CAP-AMPc); diploides parcials

a) X = cicloheximida: bloqueja els ribosomes 80S del citoplasma; la síntesi de proteïnes cau gairebé del tot i la d'ARN no canvia. Y = α-amanitina: inhibeix l'ARN polimerasa II, que fabrica els ARNm; la incorporació d'uridina baixa però no s'anul·la (40 %), perquè les ARN polimerases I i III, que fabriquen l'ARNr i l'ARNt (la major part de l'ARN), no s'inhibeixen a baixa concentració. Z = cloramfenicol: només inhibeix els ribosomes de tipus 70S, i l'única síntesi de proteïnes que afecta és la petita fracció dels mitocondris (−5 %). W = rifampicina: inhibeix l'ARN polimerasa bacteriana i no afecta les ARN polimerases nuclears eucariotes.

b) El 5 % restant és la síntesi de proteïnes als mitocondris, que tenen ADN i ribosomes propis, de tipus 70S, insensibles a la cicloheximida (i sensibles al cloramfenicol, com mostra Z). És una de les proves de la teoria endosimbiòtica: els mitocondris provenen d'un bacteri que va ser englobat per una cèl·lula ancestral.

c) Al cap d'una hora, els ribosomes continuen traduint els ARNm que ja existien. Com que no se'n fabriquen de nous i els ARNm es degraden (vida mitjana de minuts a hores), al cap de 24 hores la síntesi de proteïnes haurà caigut molt. L'efecte és retardat perquè actua sobre la transcripció, un pas anterior a la traducció.

d) E. coli té una sola ARN polimerasa (de tipus bacterià) i ribosomes 70S. Rifampicina: bloqueja la síntesi d'ARN (i, en poc temps, la de proteïnes). Cloramfenicol: bloqueja la síntesi de proteïnes. Cicloheximida i α-amanitina: cap efecte. Per això la rifampicina i el cloramfenicol són antibiòtics: actuen sobre dianes que les nostres cèl·lules no tenen (encara que el cloramfenicol pot afectar una mica els mitocondris).

Errors típics

• Pensar que la uridina marcada només mesura la síntesi d'ARNm.
• Atribuir el 5 % residual a un error experimental en lloc de la traducció mitocondrial.
• Creure que un inhibidor de la transcripció atura immediatament la síntesi de proteïnes.

Conceptes treballats: transcripció i ARN polimerases eucariotes; traducció i tipus de ribosomes; tipus d'ARN; marcatge radioactiu; teoria endosimbiòtica; antibiòtics

a) El compost que permet créixer més mutants és el més proper al final de la ruta, i un mutant creix amb tots els compostos posteriors al seu bloqueig. V permet créixer tots quatre (és el producte final); Z, tres; Y, dos; X, només un. Ordre: precursor → X → Y → Z → V. Bloquejos: mutant 3, entre el precursor i X; mutant 2, entre X i Y; mutant 1, entre Y i Z; mutant 4, entre Z i V. Cada mutant té defectuós l'enzim d'un d'aquests passos.

b) S'acumula el compost anterior al bloqueig: mutant 3, el precursor; mutant 2, X; mutant 1, Y; mutant 4, Z.

c) El mutant 1 acumula Y i l'allibera al medi. El mutant 3 està bloquejat abans de X, però pot fer Y → Z → V: si li arriba Y, creix. Per tant, el mutant 3 creixerà a prop del mutant 1. El mutant 1 no creixerà a prop del 3, perquè el 3 només acumula el precursor, que el mutant 1 ja pot transformar fins a Y però no pot passar de Y a Z. Aquesta «alimentació creuada» és una altra manera d'ordenar els passos d'una ruta.

d) Hipòtesi de Beadle i Tatum: cada gen porta la informació per fabricar un enzim, i una mutació en un gen bloqueja un sol pas d'una ruta. Avui es matisa perquè: 1) molts enzims tenen diverses cadenes polipeptídiques codificades per gens diferents, i no totes les proteïnes són enzims: es parla d'un gen, un polipèptid; 2) molts gens no codifiquen proteïnes sinó ARN funcionals (ARNr, ARNt, miARN); 3) en eucariotes, un mateix gen pot donar diversos polipèptids per splicing alternatiu.

Errors típics

• Pensar que el compost que permet créixer més mutants és el primer de la ruta.
• Dir que un mutant acumula el compost que no pot fabricar, en lloc de l'anterior al bloqueig.
• Considerar que «un gen, un enzim» encara és vàlid sense excepcions.

Conceptes treballats: relació gen-proteïna; hipòtesi un gen-un enzim; mutants auxòtrofs; rutes metabòliques; disseny i interpretació experimental

a) Hi ha una relació inversa: com més metilat és el promotor, menys s'expressa el gen. Als 3 anys les bessones són gairebé iguals; als 50, la germana fumadora té el promotor molt metilat (58 %) i l'expressió ha baixat a 0,30. Com que la seqüència és idèntica, la diferència és epigenètica: les marques de metilació es modifiquen al llarg de la vida per factors ambientals (tabac, dieta, estrès…) i per errors acumulats en copiar-les («deriva epigenètica»). Que el gen silenciat sigui un supressor de tumors suggereix un mecanisme pel qual el tabac augmenta el risc de càncer sense necessitat de mutacions.

b) Els grups metil de les citosines del promotor impedeixen la unió d'alguns factors de transcripció i atrauen proteïnes que reconeixen l'ADN metilat; aquestes recluten enzims que treuen els grups acetil de les histones. La cromatina es compacta (heterocromatina) i l'ARN polimerasa no pot accedir al promotor.

c) Després de cada replicació, la cadena nova no està metilada; un enzim de manteniment (DNMT1) copia la metilació de la cadena vella a la nova. La 5-azacitidina s'incorpora a l'ADN nou i impedeix aquesta còpia, de manera que la metilació es perd de manera passiva, a la meitat de cadenes a cada divisió: després d'una divisió, cada molècula encara té una cadena metilada; després de 5, només 1/2⁵ = 1/32 de les cadenes d'ADN conserva la metilació original. Per això l'efecte és petit al cap d'1 dia (×1,2) i gran al cap de 5 dies (×35).

d) 1) Seqüenciar el gen del tumor i comprovar que no hi ha mutacions. 2) Analitzar la metilació del promotor (per exemple amb seqüenciació després de tractar l'ADN amb bisulfit) en el tumor i en teixit sa de la mateixa persona. 3) Comprovar que el tractament desmetilant reactiva l'expressió (com a l'apartat c), amb un control sense tractar i comprovant que la metilació del promotor ha baixat. Una mutació no es revertiria amb un fàrmac desmetilant.

Errors típics

• Dir que la metilació és una mutació perquè canvia l'expressió del gen.
• Pensar que les bessones monozigòtiques han de tenir sempre la mateixa expressió gènica.
• Esperar que un fàrmac desmetilant actuï immediatament en cèl·lules que no es divideixen.

Conceptes treballats: epigenètica; metilació de l'ADN; regulació de la transcripció i cromatina; herència de les marques en la replicació; gens supressors de tumors; disseny experimental

a) És el control negatiu: té la mateixa composició i la mateixa manera d'entrar a la cèl·lula, però no és complementari de cap ARNm. Si P només baixa amb el siARN específic, l'efecte es deu a la complementarietat de seqüència i no a la transfecció ni a la presència d'un ARN estrany.

b) El siARN actua sobre l'ARNm, que es degrada en poques hores. La proteïna que ja s'havia fabricat no queda afectada: deixa de renovar-se i desapareix al ritme de la seva pròpia degradació. Entre 24 i 48 h passa de 80 a 40 % i entre 48 i 72 h de 40 a 20 %: es redueix a la meitat cada 24 h. La vida mitjana és d'unes 24 hores. Si la síntesi s'hagués aturat del tot, a les 96 h quedaria un 10 % (la meitat del 20 % de les 72 h). Però com que l'ARNm es manté al 12 %, se'n continua fabricant una mica i la proteïna s'estabilitzarà al voltant del 12 %: a les 96 h, entre un 12 i un 16 % (per exemple, 12 + (20 − 12)·½ = 16 %).

c) No hi hauria efecte (o seria mínim). Els introns s'eliminen al nucli durant la maduració i l'ARNm madur que surt al citoplasma no els conté. El complex RISC actua al citoplasma, sobre ARNm madurs, i no hi trobaria cap seqüència complementària.

d) La proteïna Dicer talla els ARN de doble cadena en fragments d'uns 21 nucleòtids; una de les cadenes s'incorpora al complex RISC, que la fa servir de guia per trobar l'ARNm complementari. Si l'aparellament és perfecte (siARN), la proteïna Argonauta del RISC talla l'ARNm, que es degrada. Els miARN són codificats pel genoma de la mateixa cèl·lula, s'aparellen de manera imperfecta (sovint a la regió 3' no traduïda) i solen inhibir la traducció de molts ARNm diferents; són un mecanisme natural de regulació de l'expressió gènica.

Errors típics

• Pensar que, si l'ARNm desapareix, la proteïna desapareix immediatament.
• Calcular la vida mitjana a partir de 0-24 h, quan la síntesi encara no s'ha aturat del tot.
• Creure que un siARN contra un intró és eficaç perquè l'intró forma part del gen.
• Aplicar la vida mitjana sense tenir en compte la síntesi residual: mentre quedi ARNm, la proteïna no tendeix a zero sinó a un valor estacionari.

Conceptes treballats: ARN d'interferència (siARN i miARN); tipus d'ARN; maduració de l'ARNm; regulació postranscripcional; vida mitjana de proteïnes; control experimental

a) En la cadena retardada, l'últim fragment d'Okazaki de l'extrem del cromosoma comença amb un encebador d'ARN; quan aquest s'elimina, no hi ha cap extrem 3' a partir del qual l'ADN polimerasa pugui omplir el buit, i la cadena nova queda més curta. A cada divisió, doncs, els telòmers (seqüències repetides no codificants) perden una mica de longitud. Com que la pèrdua és regular, la longitud dels telòmers indica quantes divisions ha fet la cèl·lula i quantes li queden: quan són massa curts, la cèl·lula activa un senyal de dany a l'ADN i entra en senescència.

b) Nadó: (10 − 5) kb / 0,1 kb per divisió = 50 divisions. Persona de 70 anys: (7 − 5) kb / 0,1 kb = 20 divisions. Les cèl·lules d'una persona gran ja han fet moltes divisions al llarg de la vida, han perdut longitud de telòmers i els en queden menys: el potencial de divisió de les cèl·lules somàtiques disminueix amb l'edat.

c) La telomerasa és un complex de proteïna i ARN (una ribonucleoproteïna). L'ARN conté una seqüència complementària de la repetició del telòmer, que fa de motlle, i la part proteica sintetitza ADN a partir d'aquest motlle d'ARN: és una transcriptasa inversa (ARN → ADN), com la dels retrovirus. Allarga l'extrem 3' del cromosoma i compensa la pèrdua de cada replicació. És activa a les cèl·lules germinals, a moltes cèl·lules mare i a la majoria de tumors.

d) Les cèl·lules tumorals poden perdre (4 − 2) kb / 0,1 kb = 20 divisions abans de morir; a una divisió per dia, l'efecte trigaria uns 20 dies a notar-se. Avantatge: les cèl·lules somàtiques normals no fan servir la telomerasa i no es veurien afectades, de manera que és un tractament força selectiu. Inconvenients: l'efecte és lent i el tumor continua creixent durant setmanes; podria afectar les cèl·lules que sí que necessiten telomerasa (cèl·lules mare de la sang, cèl·lules germinals), i algunes cèl·lules tumorals poden mantenir els telòmers per mecanismes alternatius i seleccionar-se.

Errors típics

• Pensar que els telòmers s'escurcen perquè contenen gens que es perden.
• Fer els càlculs amb la longitud total dels telòmers en lloc de la longitud que es pot perdre fins al llindar.
• Dir que la telomerasa és una ADN polimerasa normal: utilitza un motlle d'ARN propi.

Conceptes treballats: replicació de l'ADN i problema dels extrems; telòmers i telomerasa; transcriptasa inversa; senescència i càncer; tipus d'ARN; raonament quantitatiu